单四极杆液相色谱质谱联用仪-使用安益谱SQ910LC-MS同时测定7种大环内酯类药物的方法
一、方法原理
针对红霉素、罗红霉素、阿奇霉素等 7 种大环内酯类药物（含内酯环与氨基糖结构，具弱碱性），采用乙腈提取 - 正己烷除脂的前处理技术富集目标物，通过 C18 色谱柱梯度洗脱分离，利用安益谱 SQ910LC-MS 的电喷雾离子源在正离子模式下电离，形成 [M+H]⁺质子化分子离子。在多反应监测（MRM）模式下检测特征母离子与子离子，结合外标法定量。
二、仪器与试剂
（一）核心仪器
- 超高效液相色谱系统；
- 高速冷冻离心机、氮吹浓缩仪；
- 分析天平、涡旋振荡器、固相萃取装置。
（二）试剂与材料
- 标准品：红霉素、罗红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、泰乐菌素、替米考星、螺旋霉素；
- 溶剂：乙腈、甲醇（均为色谱纯），甲酸（质谱纯），正己烷（分析纯）；
- 辅助试剂：无水硫酸钠、0.22μm 有机相滤膜；
- 色谱柱：Waters Acquity BEH C18 柱；
- 基质标准：空白猪肉 / 蜂蜜基质（经检测不含目标物）。
三、样品前处理（适配食品基质）
以猪肉样品为例，其他基质可酌情调整提取溶剂比例：
- 样品制备：称取 5.0g 匀浆样品于 50mL 离心管，加入 20μL 标准工作液（1μg/mL），涡旋混匀 1min；
- 提取净化：加入 15mL 乙腈，超声提取 20min，加入 3g 无水硫酸钠，涡旋 30s，10000r/min 离心 5min，取上清液 10mL 至另一离心管；
- 除脂浓缩：加入 5mL 正己烷，涡旋 2min，静置分层后弃上层正己烷，重复除脂 2 次，收集下层溶液 40℃氮吹浓缩至近干；
- 复溶过滤：用 1mL 甲醇 - 水（1:1，v/v）复溶残渣，涡旋 1min，过 0.22μm 有机滤膜，转移至样品瓶待测。
四、定量与方法验证
- 标准曲线：以空白基质提取液配制 0.1~100ng/mL 标准系列，按前处理步骤操作，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，线性回归系数 R²≥0.999；
- 方法性能：
- 精密度：低、中、高浓度（0.5、10、80ng/mL）样品 6 次平行测定；
- 准确度：猪肉基质中加标回收率 75%~105%，蜂蜜基质中回收率 70%~108%；
- 检出限（LOD），定量限（LOQ）：优于同类检测方法；
五 、关键注意事项
- 前处理控制：
- 乙腈提取时需充分超声，确保大环内酯类药物从蛋白质结合态释放，提取效率提升至 90% 以上；
- 正己烷除脂需重复 2 次，避免脂质干扰效率，降低信噪比。
- 仪器操作与维护：
- 每日开机后用 1pg 利血平校验仪器灵敏度，确保 MRM 模式下信噪比＞10000:1；
- 色谱柱使用后用甲醇 - 水（90:10）冲洗 30min，去除柱内残留的强保留物质，延长柱效寿命；
- ESI 源每周清洁 1 次，去除喷针与锥孔残留的盐类沉积物，避免离子传输效率下降。
- 样品稳定性：
- 提取后的样品需在 4℃避光保存，24h 内完成分析，避免大环内酯类药物降解；
- 标准储备液用甲醇配制，-20℃冷冻保存，有效期 6 个月，使用前室温平衡。
