ANYEEP TQ9100 液相色谱串联质谱系统在人血清脂溶性维生素检测中的应用
技术博客 | 2025-09-18 | 阅读
维生素作为人体必需的微量有机化合物，其缺乏往往呈现进行性发展特征，早期亚临床缺乏阶段临床表现隐匿，易被忽视。但长期缺乏会引发一系列特征性健康问题：维生素 A（VA）缺乏可导致夜盲症，影响视觉功能；维生素 D（以 25 - 羟基维生素 D2、25 - 羟基维生素 D3 为主要活性形式）缺乏会干扰钙磷代谢，阻碍骨骼正常发育；维生素 E（VE）缺乏可能导致生育功能异常；维生素 K（VK1）缺乏则会破坏凝血机制，增加出血风险。
在临床诊疗与健康管理中，精准的维生素检测是评估人体营养状态、指导个性化营养补充的关键依据，尤其适用于婴幼儿、孕产妇、老年人及慢性疾病患者等特定人群的营养监测。传统检测方法常受限于单一离子源适配性、检测效率低等问题，难以满足多类脂溶性维生素同时精准分析的需求。
ANYEEP TQ9100 液相色谱串联质谱系统凭借其独特的技术设计，可同时支持电喷雾离子化源（ESI）与大气压化学电离源（APCI），无需切换离子化源或变更色谱条件，即可实现人血清中 VA、25 - 羟基维生素 D2（25OHVD2）、25 - 羟基维生素 D3（25OHVD3）、VE、VK1 五种脂溶性维生素的同步检测，为临床提供高效、精准的检测方案。
安益谱TQ9100三重四极杆液质联用仪
样品处理是确保检测准确性的基础环节，本实验采用高效且稳定的前处理步骤，具体如下：
- 取样与加样：精确吸取 200μL 待测人血清样本至 1.5mL EP 管中，加入 20μL 内标溶液以校正检测偏差，再加入 400μL 异丙醇作为蛋白沉淀剂，破坏血清中的蛋白质结构，释放出结合态的脂溶性维生素。
- 涡旋与离心：将 EP 管置于涡旋混匀仪上，以 2500rpm 的转速涡旋 5min，确保样本与试剂充分混合；随后转移至高速离心机，在 4℃低温环境下以 14000rpm 转速离心 5min，实现固液分离，去除蛋白质沉淀等杂质。
- 氮吹与复溶：吸取 500μL 离心后的上清液至 96 孔板中，置于 40℃氮吹仪下吹干，去除有机溶剂；向吹干的 96 孔板中加入 100μL 复溶液（50% 乙腈水溶液），放入微孔板震荡仪以 2000rpm 转速震摇 2min，使目标化合物充分溶解；最后以 4000rpm 转速离心 5min，取上清液作为进样样品，进样体积为 10μL 或 20μL。
为实现五种脂溶性维生素的有效分离，实验选用 Phenomenex Kinetex F5 Column（3.0mm×50mm，2.6μm）色谱柱，该色谱柱具有优异的疏水选择性与分离效率。具体色谱条件设置如下：
- 流动相：流动相 A 为含 0.1% 甲酸的水溶液，流动相 B 为含 0.1% 甲酸的甲醇溶液，通过甲酸调节 pH 值，改善目标化合物的色谱峰形与离子化效率。
- 柱温：设定为 40℃，稳定的柱温可减少保留时间波动，提高检测重复性。
- 梯度洗脱：根据 ESI 源与 APCI 源的离子化特性，采用不同的梯度洗脱程序（见表 1）。ESI 源梯度洗脱中，初始流速为 0.4mL/min，A 相占比 30%、B 相占比 70%，随时间逐步调整至 B 相 100% 并保持，最终恢复初始比例平衡色谱柱；APCI 源梯度洗脱初始流速为 0.6mL/min，A 相 50%、B 相 50%，同样通过梯度调整实现目标化合物的分离。
质谱检测采用多反应监测模式（MRM），可特异性筛选目标离子，提高检测灵敏度与抗干扰能力，具体参数如下：
- 离子化模式：同时支持 ESI+（正离子模式）与 APCI+（正离子模式），离子源温度均设定为 500℃，喷雾电压 5000V，气帘气 10psi。其中，ESI 源雾化气 50psi、辅助加热气 55psi，APCI 源雾化气 20psi、无辅助加热气；碰撞气压力为 2，入口电位（EP）7.5V，碰撞室出口电位（CXP）2V。
- 离子对参数：每种目标化合物均设定定量离子对与定性离子对，内标化合物（如 VA-d6、25OHVD2-d3、25OHVD3-d6 等）用于校正基质效应与仪器漂移（见表 2）。例如，VA 的定量离子对为 269.1→93.1（ESI 源），定性离子对为 269.1→119.3，驻留时间 20ms，去簇电压（DP）50V，碰撞能量（CE）分别为 50V 与 15V；VK1 在 APCI 源下的定量离子对为 451.4→187.1，DP 110V，CE 20V。
五种脂溶性维生素在真实样本中的提取离子图（XIC）显示，各化合物峰形对称、分离度良好，无明显干扰峰（见图 1）。同一血清样本分别经 ESI 源与 APCI 源检测，保留时间稳定：ESI 源下，VA 保留时间 2.843min、25OHVD2 2.760min、25OHVD3 2.718min、VE 4.110min、VK1 4.152min；APCI 源下，各化合物保留时间略有差异（如 VA 2.449min、VK1 4.459min），但均满足定性定量要求。
以目标化合物浓度为横坐标（x，ng/mL），峰面积与内标峰面积比值为纵坐标（Y），采用权重 1/x² 进行线性回归，结果显示（见表 3）：
- 五种脂溶性维生素的线性范围覆盖临床常见浓度区间，如 25OHVD2 为 1-50ng/mL、25OHVD3 为 1-100ng/mL、VK1 为 0.1-5ng/mL。
- 所有化合物的相关系数 r² 均大于 0.99，其中 VA（ESI 源）r²=0.9997、25OHVD3（APCI 源）r²=0.9996，表明方法线性关系优异，可准确量化不同浓度水平的目标化合物。
精密度以相对标准偏差（RSD%）评价，准确度以加标回收率评价，检测低浓度（线性范围下限 3 倍）与高浓度（线性范围上限 70%）样本，结果如下（见表 3）：
- 精密度：除 ESI 源检测 VK1 低浓度时 RSD% 为 17.9% 外，其余情况下低浓度与高浓度样本的 RSD% 均小于 10%。例如，25OHVD3（ESI 源）低浓度 RSD%=5.5%、高浓度 3.9%；VE（APCI 源）低浓度 9.1%、高浓度 5.9%，表明方法重复性良好。
- 准确度：所有化合物的加标回收率在 90.5%-105.6% 之间，如 25OHVD2（APCI 源）低浓度回收率 105.1%、高浓度 100.0%；VA（ESI 源）低浓度 102.9%、高浓度 99.2%，符合临床检测对准确度的要求。
- 双离子源兼容：无需切换 ESI 源与 APCI 源，即可完成不同脂溶性维生素的检测，简化操作流程，提高检测效率。
- 优异的检测性能：方法线性关系好（r²>0.99）、精密度高（多数 RSD%<10%）、准确度佳（回收率 90.5%-105.6%），可满足临床精准检测需求。
- 临床适用性强：覆盖临床常见脂溶性维生素种类，检测范围适配人体生理浓度，为维生素缺乏症的早期诊断、营养状况评估及个性化补充指导提供可靠的技术支持。
综上，该方法为临床实验室开展脂溶性维生素检测提供了高效、精准的解决方案，有望在妇幼保健、老年医学、慢性病管理等领域广泛应用，助力提升人体营养健康监测水平。
