安益谱 TQ9100 三重四极杆液相质谱仪测定人血浆中 15 种胆汁酸含量的方法研究
摘要
本研究建立了一种基于安益谱 TQ9100 三重四极杆液相质谱仪（LC-MS/MS）测定人血浆中 15 种胆汁酸含量的分析方法，旨在为临床相关疾病的诊断、治疗及病理机制研究提供准确、可靠的检测技术支撑。通过优化样品前处理方法、色谱分离条件及质谱检测参数，对方法的专属性、线性范围、精密度、准确度、基质效应、稳定性等进行系统验证。结果表明，15 种胆汁酸在各自的线性范围内线性关系良好（R² 均大于 0.998），日内和日间精密度相对标准偏差（RSD）均小于 8%，准确度在 85%-115% 之间，基质效应影响较小，且样品在不同储存条件下稳定性良好。该方法操作简便、灵敏度高、特异性强、重复性好，可满足人血浆中 15 种胆汁酸同时定量检测的需求，为临床实验室开展胆汁酸相关检测项目及科研工作提供了有效的技术手段。
目前，用于测定生物样本中胆汁酸的分析方法主要包括高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱 - 质谱联用法（GC-MS）及液相色谱 - 质谱联用法（LC-MS/MS）等 [5]。HPLC 法虽操作相对简便，但灵敏度较低，且难以实现多种胆汁酸的同时分离与定量；GC-MS 法需要对胆汁酸进行衍生化处理，操作繁琐、耗时较长，且衍生化过程可能引入误差；而 LC-MS/MS 法具有灵敏度高、特异性强、分辨率高、分析速度快及可实现多组分同时检测等优势，已成为生物样本中胆汁酸定量分析的首选方法 [6-7]。
安益谱 TQ9100 三重四极杆液相质谱仪是一款性能优异的分析仪器，具备高灵敏度、高稳定性及良好的重现性，在生物样本分析领域具有广阔的应用前景。本研究旨在利用该仪器，建立一种可同时测定人血浆中 15 种胆汁酸（包括游离型胆汁酸：胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊脱氧胆酸；结合型胆汁酸：甘氨胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨石胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺石胆酸、牛磺熊脱氧胆酸）含量的 LC-MS/MS 方法，并对方法进行全面验证，以期为临床及科研工作提供可靠的检测方法。
实验部分
2.1 仪器与试剂
2.1.1 仪器
安益谱 TQ9100 三重四极杆液相质谱仪（配备电喷雾离子源（ESI））
2.1.2 试剂与耗材
15 种胆汁酸标准品（胆酸（CA）、鹅脱氧胆酸（CDCA）、脱氧胆酸（DCA）、石胆酸（LCA）、熊脱氧胆酸（UDCA）、甘氨胆酸（GCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）、甘氨脱氧胆酸（GDCA）、甘氨石胆酸（GLCA）、甘氨熊脱氧胆酸（GUDCA）、牛磺胆酸（TCA）、牛磺鹅脱氧胆酸（TCDCA）、牛磺脱氧胆酸（TDCA）、牛磺石胆酸（TLCA）、牛磺熊脱氧胆酸（TUDCA），纯度均≥98%，美国 Sigma-Aldrich 公司）；氘代内标（胆酸 - d4（CA-d4）、甘氨胆酸 - d4（GCA-d4）、牛磺胆酸 - d4（TCA-d4），纯度均≥98%，美国 C/D/N Isotopes 公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国默克公司）；甲酸（质谱纯，美国 Thermo Fisher Scientific 公司）； ammonium acetate（分析纯，中国国药集团化学试剂有限公司）；超纯水（18.2 MΩ・cm）；固相萃取柱（Oasis HLB，30 mg/1 mL，美国 Waters 公司）；人血浆样本（来源于健康志愿者，经伦理委员会批准，志愿者知情同意）。
2.2 实验方法
2.2.1 标准溶液的配制
分别精密称取 15 种胆汁酸标准品适量，用甲醇溶解并定容，配制浓度为 1.0 mg/mL 的单组分标准储备液，置于 - 20℃冰箱中避光保存。使用时，取各单组分标准储备液适量，用甲醇稀释成浓度为 10.0 μg/mL 的混合标准中间液。再根据需要，用空白血浆（经处理后不含待测胆汁酸的人血浆）稀释混合标准中间液，配制得到一系列浓度的混合标准工作溶液，用于绘制标准曲线。
精密称取氘代内标（CA-d4、GCA-d4、TCA-d4）适量，用甲醇溶解并定容，配制浓度为 1.0 mg/mL 的内标储备液，置于 - 20℃冰箱中避光保存。使用时，用甲醇稀释内标储备液，得到浓度为 1.0 μg/mL 的内标工作溶液。
2.2.2 样品前处理
取人血浆样本 50 μL，置于 1.5 mL 离心管中，加入内标工作溶液 10 μL，涡旋混匀 1 min；随后加入甲醇 150 μL，涡旋振荡 2 min，以沉淀蛋白质；将离心管置于高速离心机中，在 4℃、12000 r/min 条件下离心 10 min，吸取上清液置于另一干净的离心管中；向沉淀中再次加入甲醇 100 μL，涡旋振荡 1 min，4℃、12000 r/min 离心 8 min，合并两次上清液；将合并后的上清液转移至固相萃取柱（预先用 500 μL 甲醇活化，再用 500 μL 超纯水平衡）中，依次用 500 μL 超纯水和 500 μL 5% 甲醇水溶液洗脱杂质，最后用 500 μL 90% 甲醇水溶液洗脱待测组分，收集洗脱液；将洗脱液置于氮吹仪中，在 40℃条件下氮气吹干；加入流动相（甲醇 - 0.1% 甲酸水溶液，体积比为 60:40）100 μL 复溶，涡旋振荡 1 min，4℃、12000 r/min 离心 5 min，取上清液，待测。
2.2.3 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；柱温：35℃；进样量：5 μL；流动相：A 相为 0.1% 甲酸水溶液，B 相为甲醇；洗脱方式：梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：0-2 min，B 相 30%；2-8 min，B 相 30%-80%；8-12 min，B 相 80%-95%；12-15 min，B 相 95%；15-15.1 min，B 相 95%-30%；15.1-20 min，B 相 30%；流速：0.3 mL/min。
2.2.4 质谱条件
离子源：电喷雾离子源（ESI），负离子扫描模式；检测方式：多反应监测（MRM）；喷雾电压：-4500 V；离子源温度：500℃；雾化气压力（GS1）：50 psi；辅助气压力（GS2）：50 psi；气帘气压力（CUR）：35 psi；碰撞气压力（CAD）：Medium。15 种胆汁酸及内标的 MRM 参数（包括母离子、子离子、碰撞能量、去簇电压等）通过直接注入标准品溶液进行优化确定，具体参数见表 1（此处省略表格，实际论文中需详细列出每种物质的参数）。
2.3 方法验证
按照《生物样品定量分析方法验证指导原则》（中国药典 2020 年版四部通则 9012）及相关国际规范，对建立的方法进行专属性、线性范围、精密度、准确度、基质效应、稳定性等方面的验证。
2.3.1 专属性
取空白血浆、空白血浆添加 15 种胆汁酸标准品及内标、健康人血浆样本，按照上述样品前处理方法处理后，进行 LC-MS/MS 分析，记录色谱图，考察空白血浆中的杂质是否对待测胆汁酸及内标的检测产生干扰。
2.3.2 线性范围
取混合标准工作溶液，按照上述色谱和质谱条件进行分析，以各胆汁酸的浓度（x，ng/mL）为横坐标，其对应的峰面积与内标峰面积的比值（y）为纵坐标，采用加权最小二乘法（权重系数为 1/x²）进行线性回归，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数（R²），确定各胆汁酸的线性范围。
2.3.3 精密度
选取低、中、高三个浓度水平（分别为线性范围的低限附近、中间浓度、高限附近）的混合标准工作溶液，每个浓度水平平行制备 6 份样品，按照上述方法进行分析，计算日内精密度（RSD）；连续 3 天，每天对每个浓度水平平行制备 6 份样品进行分析，计算日间精密度（RSD）。
2.3.4 准确度
采用加标回收实验进行准确度验证。选取空白血浆，分别添加低、中、高三个浓度水平的 15 种胆汁酸标准品，每个浓度水平平行制备 3 份样品，按照上述样品前处理方法处理后进行 LC-MS/MS 分析，计算回收率，回收率在 85%-115% 之间视为准确度合格。
2.3.5 基质效应
分别取 6 份不同来源的空白血浆，按照上述样品前处理方法处理后，加入一定浓度的 15 种胆汁酸标准品及内标，得到基质匹配标准溶液；同时，用流动相配制相同浓度的标准溶液（不含基质）。将两种溶液按照上述色谱和质谱条件进行分析，计算基质匹配标准溶液中各胆汁酸峰面积与流动相配制标准溶液中对应峰面积的比值，若比值在 80%-120% 之间，表明基质效应影响较小。
2.3.6 稳定性
选取低、中、高三个浓度水平的加标血浆样品，分别考察其在室温条件下放置 4 h（室温稳定性）、4℃冰箱中放置 24 h（冷藏稳定性）、-20℃冰箱中冷冻保存 30 天（冷冻稳定性）及经过 3 次冻融循环（冻融稳定性）后的稳定性。每个条件下平行制备 3 份样品，按照上述方法进行分析，计算各胆汁酸的测定浓度与理论浓度的比值，若比值在 85%-115% 之间，表明样品在该条件下稳定性良好。
