三重四极杆液质联用仪-ANYEEP TQ9100液相色谱串联质谱法同时测定人血浆中变肾上腺素类物质及3-甲氧酪胺的方法建立与验证
摘要：目的 建立基于ANYEEP TQ9100液相色谱串联质谱系统的检测方法，实现人血浆中甲氧基肾上腺素（MN）、甲氧基去甲肾上腺素（NMN）及3-甲氧酪胺（3-MT）的同时定量分析，为嗜铬细胞瘤和副神经节瘤等疾病的临床诊断提供技术支撑。方法 血浆样本经固相萃取（SPE）预处理后，采用Phenomenex Kinetex F5色谱柱进行分离，以水（含0.1%甲酸）-乙腈为流动相进行梯度洗脱；质谱检测采用电喷雾离子化源正离子模式（ESI+）结合多反应监测模式（MRM），对离子源温度、喷雾电压等参数进行优化。验证该方法的线性范围、精密度、准确度等关键方法学指标。结果 MN、NMN和3-MT的保留时间分别为2.243 min、2.209 min和2.243 min，在10-1000 pg/mL浓度范围内线性关系良好（r²均≥0.996）；低、中、高三个浓度水平的精密度相对标准偏差（RSD）均小于10%，回收率介于91.7%-106.3%之间。结论 本方法操作简便、分离效果佳、灵敏度高、准确度与重复性良好，可满足临床样本中变肾上腺素类物质及3-MT的常规检测需求。
引言
儿茶酚胺（Catecholamine, CA）作为人体关键的神经递质与激素，其代谢异常与多种内分泌及神经系统疾病密切相关。在嗜铬细胞内，CA可在儿茶酚-O-甲基转移酶（Catechol-O-methyltransferase, COMT）的催化下生成变肾上腺素类物质（Metanephrines, MNs），主要包括甲氧基肾上腺素（Metanephrine, MN）和甲氧基去甲肾上腺素（Normetanephrine, NMN）。与CA相比，MNs具有半衰期更长、理化性质更稳定的特点，且能直接反映嗜铬细胞的功能状态，因此被《嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断治疗专家共识（2020版）》《中国继发性高血压临床筛查多学科专家共识（2023）》等权威指南推荐为嗜铬细胞瘤、副神经节瘤等疾病诊断的首选生物标志物。
3-甲氧酪胺（3-Methoxytyramine, 3-MT）作为多巴胺的重要代谢产物，其血浆含量变化对神经内分泌肿瘤的辅助诊断也具有重要参考价值。目前，临床及科研中用于检测MNs的方法主要包括高效液相色谱法（HPLC）和免疫分析法，但HPLC法存在灵敏度不足的缺陷，免疫分析法则受交叉反应影响导致特异性较差，均难以满足临床对检测精准度的高要求。液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术凭借高灵敏度、高特异性、多组分同时检测的优势，已成为生物样本中微量物质分析的首选技术。本研究旨在基于安益谱全自主研发的ANYEEP TQ9100三重四极杆串联质谱系统，建立一种可同时测定人血浆中MN、NMN及3-MT的LC-MS/MS方法，并对其方法学性能进行系统验证，为相关疾病的临床诊断与监测提供可靠的技术方法。
实验部分
1 主要仪器与试剂
仪器：ANYEEP TQ9100液相色谱串联质谱系统（含自动进样器、柱温箱、电喷雾离子源，安益谱科技）；高速涡旋振荡器（德国IKA）；正压固相萃取装置（美国Agilent）；氮气吹干仪（中国天津恒奥）；1.5 mL EP管（美国Axygen）；WCX填料96孔固相萃取板（美国Waters）。
试剂：甲氧基肾上腺素（MN）标准品、甲氧基去甲肾上腺素（NMN）标准品、3-甲氧酪胺（3-MT）标准品（纯度均≥98%，美国Sigma）；氘代内标MN-d3、NMN-d3、3-MT-d4（纯度均≥98%，美国C/D/N Isotopes）；甲酸（色谱纯，美国Thermo）；乙腈（色谱纯，美国Merck）；超纯水（由Milli-Q超纯水机制备，美国Millipore）。
2 样品处理
3 色谱条件
4 质谱条件
表1 梯度洗脱条件
时间（min） | 流速（mL/min） | A相（%） | B相（%） |
|---|---|---|---|
0 | 0.25 | 95 | 5 |
1.5 | 0.25 | 95 | 5 |
2.8 | 0.25 | 90 | 10 |
2.9 | 0.25 | 5 | 95 |
3.4 | 0.25 | 5 | 95 |
3.5 | 0.25 | 95 | 5 |
6.0 | 0.25 | 95 | 5 |
表2 MNs、3-MT及内标MRM离子对参数
待测物名称 | Q1离子 | Q3离子 | 驻留时间（ms） | CE（V） | DP（V） |
|---|---|---|---|---|---|
MN* | 180.1 | 148.1 | 20 | 12 | 110 |
MN | 180.1 | 120.1 | 20 | 12 | 110 |
MN-d3 | 183.1 | 151.1 | 20 | 12 | 110 |
NMN* | 166.1 | 134.1 | 20 | 10 | 50 |
NMN | 166.1 | 121.1 | 20 | 10 | 50 |
NMN-d3 | 169.1 | 137.1 | 20 | 10 | 50 |
3-MT* | 151.1 | 91.1 | 20 | 17 | 120 |
3-MT | 151.1 | 119.1 | 20 | 15 | 120 |
3-MT-d4 | 155.1 | 95.1 | 20 | 15 | 105 |
注：*为定量离子对
结果与讨论
1 方法学验证结果
1.1 线性关系与定量下限
精密配制一系列不同浓度的MN、NMN及3-MT混合标准工作液，加入空白血浆中制备成浓度为10、25、50、100、200、500、1000 pg/mL的基质匹配标准曲线样本，按“2 样品处理”方法处理后进行LC-MS/MS分析。以各待测物与对应内标的峰面积比值（Y）为纵坐标，以待测物的浓度（X，pg/mL）为横坐标，采用权重系数1/x进行线性回归分析，绘制标准曲线。结果显示，MN、NMN和3-MT在10-1000 pg/mL浓度范围内均呈现良好的线性关系，相关系数r²均≥0.996，表明该方法在该浓度范围内定量准确可靠。以信噪比（S/N）≥10为定量下限（LLOQ），三种化合物的LLOQ均为10 pg/mL，满足临床样本中低浓度目标物的检测需求。MN、NMN和3-MT的LLOQ提取离子图见图1，从图中可看出，目标峰分离度良好，无明显基质干扰。
1.2 精密度与准确度
选取低（25 pg/mL）、中（100 pg/mL）、高（500 pg/mL）三个浓度水平的MN、NMN及3-MT质控样本，每个浓度水平平行制备6份，按建立的方法进行检测，连续测定3天，计算日内精密度和日间精密度（以RSD%表示）；同时计算各浓度水平的回收率（以准确度表示）。结果显示，三种化合物在不同浓度水平下的日内及日间RSD均小于10%，回收率介于91.7%-106.3%之间，符合生物样本分析方法验证指导原则的要求，表明该方法具有良好的精密度和准确度。具体线性范围、回归方程、相关系数、精密度及回收率结果见表3。
表3 MN、NMN、3-MT的保留时间、线性范围、回归方程、精密度和准确度结果
化合物 | 保留时间（min） | 线性范围（pg/mL） | 回归方程 | 相关系数（r²） | RSD% | 回收率% |
|---|---|---|---|---|---|---|
MN | 2.243 | 10-1000 | Y=0.005450X+0.125965 | 0.9987 | 6.5%5.9%5.3% | 99.9%99.2%91.7% |
NMN | 2.209 | 10-1000 | Y=0.006552X+0.668148 | 0.9984 | 7.6%6.2%8.3% | 106.3%105.7%96.7% |
3-MT | 2.243 | 10-1000 | Y=0.002384X+0.777170 | 0.9965 | 6.7%9.0%4.5% | 101.8%95.6%93.9% |
注： 上行数据为低浓度，中间行为中浓度，下行为高浓度； 低浓度加标浓度25 pg/mL，中浓度100 pg/mL，高浓度500 pg/mL
图1 MN、NMN和3-MT LLOQ提取离子图
从上到下依次为MN、NMN和3-MT
2 方法优势与临床应用价值
本研究建立的LC-MS/MS方法采用固相萃取预处理技术，可有效去除血浆基质中的蛋白质、脂质等干扰物质，提高目标物的提取效率和检测纯度；色谱分离采用梯度洗脱模式，在6 min内即可完成三种目标物的分离与检测，分析效率高；质谱检测采用MRM模式，结合氘代内标定量，有效减少了基质效应和仪器波动对检测结果的影响，提高了方法的灵敏度和准确性。与传统的HPLC法和免疫分析法相比，本方法具有多组分同时检测、灵敏度高、特异性强、分析速度快等显著优势。
临床实践中，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤的早期诊断较为困难，MNs作为首选标志物，其精准检测对疾病的筛查、诊断及疗效监测具有关键作用。3-MT作为多巴胺代谢产物，其含量变化可辅助反映神经内分泌系统的功能状态，与MNs联合检测可进一步提高相关疾病诊断的准确性。本方法可同时实现这三种物质的定量检测，为临床提供全面、可靠的检测数据，具有重要的临床应用价值。此外，本方法采用的ANYEEP TQ9100液相色谱串联质谱系统为国产自主研发仪器，相比进口仪器具有更高的性价比和更便捷的售后服务，有利于该方法在基层医疗机构的推广应用。
结论
本研究成功建立了基于ANYEEP TQ9100液相色谱串联质谱系统同时测定人血浆中MN、NMN及3-MT的分析方法。该方法线性关系良好、精密度高、准确度好、分析速度快，能有效满足临床样本中目标物的检测需求。该方法的建立不仅为嗜铬细胞瘤和副神经节瘤等疾病的临床诊断提供了可靠的技术手段，也为国产质谱仪器在临床检测领域的应用提供了有力支撑。后续可进一步扩大样本量，开展临床验证研究，优化检测流程，推动其在临床常规检测中的广泛应用。
