三重四极杆液质联用仪-基于安益谱 TQ 9100 三重四极杆串联质谱系统的血浆中变肾上腺素类物质与 3 - 甲氧酪胺同时检测方法
一、方法原理
血浆中变肾上腺素（E）、去甲变肾上腺素（NE）及 3 - 甲氧酪胺（3-MT）为儿茶酚胺类微量代谢物（浓度多为 pg/mL 级），且血浆基质含大量蛋白质、脂质及内源性干扰物。本方法利用蛋白沉淀 - 固相萃取（SPE） 联用技术实现目标物富集与净化，结合安益谱 TQ 9100 的高效电喷雾离子源（ESI）与三重四极杆多反应监测（MRM）模式：通过 ESI 正离子模式将目标物电离为质子化分子离子 [M+H]⁺，三重四极杆精准筛选特征母离子与子离子，有效排除基质干扰；采用稳定同位素标记内标（如 E-d₃、NE-d₃、3-MT-d₄）校正前处理损失与基质效应，最终实现三种物质的同时定性与定量。TQ 9100 的全自主研发硬件（如高灵敏度离子源、快速扫描四极杆）可确保 pg/mL 级检测限，满足临床及科研对血浆中痕量儿茶酚胺代谢物的检测需求。
二、仪器与试剂
（一）主要仪器
- 高速冷冻离心机；
- 固相萃取装置；
- 氮吹仪；
- 分析天平；
- 涡旋振荡器；
- 具塞离心管；
- 固相萃取柱；
- 0.22μm 水系微孔滤膜；
- 移液器。
（二）主要试剂
三、实验步骤
（一）样品前处理
（二）仪器条件设置
（三）标准曲线绘制（适配血浆痕量检测）
（四）样品测定
按仪器条件测定待测血浆样品溶液，根据保留时间与 MRM 离子对丰度比定性；通过基质匹配标准曲线计算血浆中 E、NE、3-MT 的浓度（单位：pg/mL）。
四、方法验证（符合生物样品分析规范）
（一）线性关系
E、NE、3-MT 在 0.5-500pg/mL 浓度范围内线性良好，加权回归相关系数（R²）均≥0.999，满足血浆中痕量物质定量要求（TQ 9100 的低噪声信号确保低浓度点线性拟合准确）。
（二）检测限（LOD）与定量限（LOQ）
（三）精密度与准确度
- 精密度：取低（2pg/mL）、中（50pg/mL）、高（200pg/mL）3 个浓度基质匹配标准工作液，平行测定 6 次（日内精密度），连续测定 3 天（日间精密度）。
- 准确度：取空白血浆进行低（2pg/mL）、中（50pg/mL）、高（200pg/mL）3 个浓度水平加标回收实验，每个水平平行测定 3 次。
（四）稳定性
- 血浆样品稳定性：空白血浆加标样品（50pg/mL）在 4℃放置 6h、-80℃冷冻 30 天、反复冻融 3 次后，测定浓度 RSD 均≤9.0%，表明样品稳定性良好。
- 待测液稳定性：前处理后的待测液在 10℃进样器中放置 24h，浓度 RSD≤6.5%，满足批量样品检测需求。
五、注意事项
- 血浆处理特殊性：血浆采集后需立即加入抗凝剂（如 EDTA-K2），4℃离心 15min 分离血浆，-80℃冷冻保存，避免室温放置导致目标物降解；解冻时需缓慢融化，避免反复冻融。
- SPE 柱操作控制：MCX 柱活化后需保持柱床湿润，上样与洗脱流速需严格控制在 0.5-1mL/min，避免流速过快导致目标物吸附不充分或洗脱不完全（TQ 9100 的高灵敏度可检出微量损失，但需尽量优化）。
- TQ 9100 维护适配：每日开机后用利血平标准品（1ng/mL）校准质谱灵敏度与质量轴（TQ 9100 支持自主校准程序，10min 内完成）；每检测 50 个血浆样品后，更换进样口隔垫并冲洗色谱柱（用 10% 甲醇水冲洗 30min），防止基质残留污染。
- 试剂与内标控制：甲酸、氨水需选择低杂质级别（如 LC-MS 级），避免引入背景干扰；内标工作液需单独配制，避免与标准品交叉污染，定期核查内标纯度（通过 TQ 9100 的 MRM 模式确认无干扰峰）。
- 生物安全防护：血浆样品需按生物安全二级标准处理，实验后离心管、进样瓶等需高压灭菌后丢弃；接触血浆的移液器吸头需专用，避免交叉污染。
