基于 ANYEEP TQ9100 液相色谱串联质谱系统的人血清脂溶性维生素检测方法研究
技术博客 | 2025-09-02 | 阅读
一、引言：脂溶性维生素检测的临床意义与技术需求
脂溶性维生素（维生素 A、D、E、K）是人体必需的微量营养素，虽无法自主合成，却在生理代谢中发挥关键作用：维生素 A（VA）维持视觉功能与上皮组织完整性，缺乏易致夜盲症；25 - 羟基维生素 D2（25OHVD2）、25 - 羟基维生素 D3（25OHVD3）调控钙磷代谢，不足会引发骨骼发育异常；维生素 E（VE）作为抗氧化剂保护细胞膜，缺乏可能导致生育功能异常；维生素 K1（VK1）参与凝血因子合成，缺乏易造成凝血功能障碍。
此类维生素缺乏多呈 “亚临床渐进性”，早期无明显症状，长期不足才显现特征性病症，因此临床精准检测至关重要。传统检测方法（如高效液相色谱法 HPLC）存在灵敏度低、无法同时区分同系物（如 25OHVD2 与 25OHVD3）等局限，而液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）凭借高特异性与高灵敏度，成为脂溶性维生素检测的优选技术。
ANYEEP TQ9100 液相色谱串联质谱系统创新性支持电喷雾离子化源（ESI）与大气压化学电离源（APCI）双模式，无需切换离子源或变更色谱条件即可完成 5 种脂溶性维生素的同步检测，为临床血清样本分析提供高效、便捷的技术方案。
安益谱TQ9100三重四极杆液质联用仪
- 主仪器：ANYEEP TQ9100 液相色谱串联质谱系统（配备 ESI/APCI 双离子源、自动进样器、柱温箱）；
- 色谱柱：Phenomenex Kinetex F5 Column（3.0mm×50mm，2.6μm），该柱基于五氟苯基固定相，对脂溶性化合物具有优异的保留与分离性能，可有效区分结构相似的维生素同系物；
- 辅助设备：涡旋振荡器（转速 0~3000rpm）、高速离心机（低温可控 4℃，最高转速 15000rpm）、氮吹仪（控温范围 30~60℃）、微孔板震荡仪（转速 0~3000rpm）。
- 提取溶剂：异丙醇（色谱纯），用于沉淀血清中的蛋白质，释放脂溶性维生素；
- 流动相：流动相 A 为含 0.1% 甲酸的超纯水，流动相 B 为含 0.1% 甲酸的甲醇（均为质谱级），甲酸的添加可提升正离子模式下的离子化效率；
- 复溶液：50% 乙腈（色谱纯），平衡样品基质与流动相，减少基质效应；
- 标准品与内标：VA、25OHVD2、25OHVD3、VE、VK1 标准品（纯度≥98%）；VA-d6、25OHVD2-d3、25OHVD3-d6、VE-d6、VK1-d4 内标物（纯度≥99%），用于校正样品前处理损失与仪器响应波动。
血清中含有大量蛋白质与脂质，需通过 “沉淀 - 提取 - 浓缩 - 复溶” 四步处理去除基质干扰，具体步骤如下：
- 取样与加标：取 200μL 待测血清样本于 1.5mL EP 管中，加入 20μL 内标溶液（确保内标在样本中的终浓度与标准品一致），再加入 400μL 异丙醇；
- 蛋白沉淀与离心：2500rpm 涡旋混匀 5min，使异丙醇充分沉淀蛋白质；4℃条件下 14000rpm 离心 5min，分离上清液（含目标维生素）与蛋白沉淀；
- 浓缩干燥：取 500μL 上清液转移至 96 孔板中，40℃氮吹至干（避免高温导致维生素降解）；
- 复溶与进样：加入 100μL 50% 乙腈复溶液，2000rpm 震摇 2min 使残留物充分溶解；4000rpm 离心 5min 去除微小杂质，取 10~20μL 上清液进样分析。
该流程无需固相萃取等复杂步骤，单样本处理时间仅需 30min，兼顾效率与纯度，可满足临床批量样本检测需求。
针对 ESI 与 APCI 源的离子化特性，设计差异化梯度洗脱程序，确保 5 种维生素在两种离子源模式下均能实现良好分离，具体参数见表 1。
表 1 梯度洗脱条件
注：A 相为水（含 0.1% 甲酸），B 相为甲醇（含 0.1% 甲酸）；柱温恒定 40℃，避免温度波动影响保留时间稳定性。
采用正离子模式（ESI+、APCI+），通过优化离子源温度、喷雾电压、碰撞能量等参数，确定每种维生素的特征离子对（1 对定量离子对 + 1 对定性离子对），确保检测特异性与灵敏度，核心参数见表 2。
表 2 脂溶性维生素及内标 MRM 离子对参数
注：DP 为去簇电压，CE 为碰撞能量；ESI 源雾化气 50psi、辅助加热气 55psi，APCI 源雾化气 20psi、无辅助加热气；气帘气统一为 10psi，EP 7.5V，CXP 2V。
通过线性范围、相关系数、精密度（RSD%）、准确度（回收率 %）四项核心指标，验证方法的可靠性，结果见表 3。
表 3 脂溶性维生素保留时间、线性范围、回归方程、精密度和准确度结果
注：低浓度为线性范围下限的 3 倍，高浓度为线性范围上限的 70%；RSD%≤10%（除 ESI 源 VK1 低浓度 17.9%，可能因 VK1 在低浓度下受基质干扰略高），回收率 90.5%-105.6%，符合临床检测要求。
- 分离效果：各维生素色谱峰形对称，无明显拖尾或重叠，VA、25OHVD2、25OHVD3 保留时间集中在 2.3-2.9min，VE、VK1 集中在 4.1-4.5min，分离度均≥1.5；
- 信号响应：目标离子峰信号强，背景噪声低，如 25OHVD2（0.11ng/mL）、25OHVD3（12ng/mL）、VE（8.1μg/mL）等均能准确检出，且内标峰与目标峰无干扰；
- 双源一致性：同一血清样本在 ESI 与 APCI 源下的检测结果偏差≤8%，说明两种离子源均可稳定用于检测，无需因样本差异切换离子源，提升操作便捷性。
- 双离子源兼容：无需更换离子源或调整色谱条件，即可实现两种离子化模式切换，适配不同极性的脂溶性维生素（如极性略高的 25OHVD2/25OHVD3 更适合 ESI，非极性的 VK1 更适合 APCI）；
- 高灵敏度与特异性：MRM 模式结合内标法，最低检出限（LOD）可达 0.03ng/mL（VK1），远低于临床诊断阈值，且能有效区分 25OHVD2 与 25OHVD3（传统方法易混淆）；
- 高效便捷：样品处理流程简化，单样本检测时间（含前处理）≤40min，支持 96 孔板批量进样，日均可检测 100 + 样本，满足临床实验室高效需求。
